觀察GFP和包括FITC在內(nèi)的綠色熒光，都可以使用nightsea的體視顯微鏡熒光適配器(Stereo Microscope Fluorescence Adapter)，這毫無問題。我們經(jīng)常遇到的問題是：是用下圖中黃色的longpass濾光片好呢？還是選擇綠色的bandpass濾光片好。

答案是：不能一概而論，常要視具體情況來做出選擇。下文分析一下兩者各自的優(yōu)缺點。

  Longpass：可以透過任何超過~500nm波長的光

  Bandpass：透光波長以~530nm為中心，透光波長范圍約~60nm。

就是說bandpass只能透過綠色光，而longpass可以透過的光包括了綠，黃，橙和紅色。

濾光片有何作用？

濾光片就是用來強化預(yù)觀察的熒光信號的：它能擋住(源于激發(fā)光源的)反射光，同時透過我們想觀察的熒光信號。在實際觀察中常常受到來自觀測區(qū)域內(nèi)其它潛在熒光信號的干擾（噪音），這類背景熒光信號可能來自培養(yǎng)基（線蟲研究中常會有此問題），或是其它東西（例如植物葉綠素和發(fā)育中的斑馬魚的yolk發(fā)出的熒光信號）。

Longpass和bandpass在阻擋激發(fā)光上都沒有問題。問題焦點是面對這些噪音信號，兩者中哪個才是正確的選項？

如果背景信號和你要觀察的信號在波長上不存在重疊，那應(yīng)該選擇bandpass濾光片。如下圖所示，擬南芥（或其它植物）的葉綠素發(fā)出紅色熒光，其波長峰值約為685 nm，bandpass可以將它過濾掉，這樣就可以輕松觀察GFP信號而不再受到它的干擾（*張顯示longpass濾光片下存在信號疊加，第二張bandpass下只余下綠色熒光）。

擬南芥圖片由波士頓大學(xué)John Celenza博士惠贈。

更多圖片鏈接：http://www.nightsea。。ｃｏｍ/articles/green-bandpass/

但是，在所要觀察的熒光信號與背景信號波長存在交叉疊加時，將背景信號過濾掉則可能引起問題。這時，使用longpass濾光片保留背景信號更好：可以通過信號的強度和顏色的對比來區(qū)分（哪是要觀察的熒光信號，哪是背景信號）。下面是一條轉(zhuǎn)熒光基因的斑馬魚圖片。這條斑馬魚在心臟表達(dá)GFP，在血細(xì)胞表達(dá)mCherry。Longpass（上端）就可以將此區(qū)分出來，而bandpass（下端）就不能。上端圖像可以呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光心臟，紅色熒光血細(xì)胞，還有yolk天然發(fā)出的黃色熒光。而在選擇bandpass濾光片所獲的圖像里，滿眼是強弱不等的綠色，這些綠色并不全是來自GFP的表達(dá)，因此容易造成混亂和誤判。

斑馬魚圖片由Williams大學(xué)Martha Marvin博士惠贈，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚由Buffalo大學(xué)Lara Hutson博士雜交培育。

有的情況下，則兩種濾光片都可以。線蟲培基可以呈現(xiàn)綠色熒光背景，同樣是面對這一場景，有的觀測人員傾向使用bandpass，有的傾向用longpass，前者認(rèn)為bandpass比longpass增加了一些清晰度和對比度?？傊?，面對此種情景，個人偏好在zui終選擇上起了關(guān)鍵作用。

如果是探索自然界的熒光信號，那沒有疑問，應(yīng)該選擇longpass。選擇bandpass的話，你可拍不出下圖藿香薊花的美妙來！

該文英文由Nightsea提供

http://www.nightsea。。ｃｏｍ/sfa-sharing/longpass-vs-bandpass-barrier/

該文由群曉科苑翻譯，群曉科苑為nightsea授權(quán)代理商。

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